細胞學堂 | 貼壁細胞6大培養難題原因和解決方法

更新時間：2023-03-24 | 點擊率：2359

貼壁細胞在培養時要貼附于培養（瓶）器皿壁上，細胞一經貼壁就迅速鋪展，然后開始有絲分裂，并很快進入對數生長期。

貼壁細胞因其培養過程較為繁瑣，所以培養時更容易出現問題。以下總結了貼壁細胞培養中常見的6種問題，并詳細介紹原因和解決方法，若培養時遇到這些情況，可參考對應解決方法處理。

傳代后細胞全部飄起

解決方法：檢查所使用的培養基的顏色是否偏紫色（如圖1），檢查瓶蓋是否透氣，不透氣瓶蓋是否被擰松。

圖1. 培養基顏色偏紫

通常培養基偏堿，顏色就會偏紫，主要是因為培養基里的酚紅指示劑遇酸變黃、遇堿變紫，培養基量太少，或培養基存放時間太長時都會變堿。建議配好完-全培養基后分裝到50mL離心管并于一周內用完，量少時放到15mL離心管里保存。

傳代后部分細胞漂浮

原因及解決方法如下

傳代前細胞密度太大：一般細胞匯合度達到80%時可進行傳代操作，傳代密度需適中，傳代密度過高也會導致傳代后漂浮；

細胞狀態不好：可通過提高血清比例、穩定培養環境等方法進行改善；

吹打次數過多造成機械損傷：輕柔吹打，細胞呈單顆粒時可停止吹打，吹打過程避免氣泡產生；

培養基更換后不適應：更換回原來的培養基；或者與原培養基比例混合后使用，使細胞有個適應期。

傳代后細胞變形

原因及解決方法如下

1）變形，但細胞還在生長：可能是血清批次不一樣導致，血清成分復雜，不同批次和品牌間均存在成分差異，影響細胞狀態。建議使用同一批次血清，更換血清時需與原血清比例混合后使用，使細胞有過渡期；

2）變形，但細胞不長，且碎片增多：可能傳代操作過程損傷，常見于消化不當，或者潛在支原體等污染導致細胞病態；消化時間根據每個細胞的狀態來調整，消化過度或者消化不充分均會對細胞造成影響；培養過程應嚴格無菌操作，實驗環境盡量潔凈，確保細胞無外源污染。

細胞生長周期變慢，邊養邊漂

原因及解決方法如下

細胞傳代時密度太稀或太密：建議細胞密度達80%左右進行傳代，傳代密度適中，密度過低會延長生長周期；

傳代操作不當：根據細胞特性決定細胞消化時間，一般在顯微鏡下觀察細胞回縮變圓并有少量細胞脫落即可終止消化，難消化的細胞可分次消化，每次時間不超過5min；頻繁換液或者清洗細胞也會導致細胞狀態變差，常規換液時間間隔為2~3天。

傳代后細胞成團

解決方法如下

低密度接種，延長換液時間，防止細胞脫落；

使用多聚賴氨酸包被培養器皿，以增加細胞貼壁牢固度，降低細胞聚集成團的幾率；

重新鋪板，并更換新配制的培養基，加大血清比例（增加比例不超過5%）；

接種時，減少培養基量（如T25加3mL）以加快細胞貼壁速度，等待細胞貼壁后（約8-12小時），再補加培養基到正常用量。

細胞出現空泡

原因及解決方法如下

1）正常的細胞活動：有的細胞有正常的自噬行為或其他膜泡活動，無需特殊處理（如Caco-2細胞）；

2）血清不適應、培養基成分改變、換液不及時等造成細胞營養不良：可通過更換更合適的血清或及時換液等方法解決；

3）機械損傷、PH偏高或偏低等造成細胞受損：注意培養條件及操作手法。