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巨噬細(xì)胞（Macrophages）是一種位于組織內(nèi)的白血球，源自單核細(xì)胞，單核細(xì)胞來源于骨髓中的前體細(xì)胞。巨噬細(xì)胞在生物體內(nèi)扮演著多重角色，它們可以吞噬和清除異物和衰老死亡細(xì)胞、分泌生物活性物質(zhì)、調(diào)節(jié)血細(xì)胞生成和參與免疫應(yīng)答等，是一類在體內(nèi)發(fā)揮重要免疫效應(yīng)的細(xì)胞，并且也是實驗室最-常用的細(xì)胞種類之一。
骨髓來源巨噬細(xì)胞（Bone Marrow Derived Macrophage）是從大鼠或者其他哺乳動物骨髓中的單個核細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞因子誘導(dǎo)分化得到的一種原代巨噬細(xì)胞。本期，我們將以大鼠為例，分享骨髓來源巨噬細(xì)胞分離提取和培養(yǎng)注意事項，幫助您順利上手開展實驗。
分離提取步驟
一、分離脛骨和股骨
取2周齡的健康大鼠，斷頸法處死；
用超純水清洗大鼠2次，再用75%酒精浸泡5 min，進(jìn)行表面除菌處理；
將消毒后的動物轉(zhuǎn)運(yùn)至超凈工作臺內(nèi)；
無菌條件下，用第一套無菌剪刀和鑷子剪開腿部皮膚，充分暴露兩側(cè)股骨；
更換第二套無菌剪刀和鑷子，從大腿根部關(guān)節(jié)處和腳后跟關(guān)節(jié)處剪斷，分離腿部肌肉，取出脛骨和股骨，將其放在含有PBS的培養(yǎng)皿內(nèi)。
圖1. 分離的脛骨和股骨
二、沖洗骨髓
更換第三套無菌剪刀和鑷子，清理脛骨和股骨表面殘留的肌肉組織，注意保證骨頭完整；
留取純凈骨頭，將其轉(zhuǎn)移至新的含有PBS的培養(yǎng)皿內(nèi)；
取一個新培養(yǎng)皿，加10 mL大鼠骨髓來源巨噬細(xì)胞完-全培養(yǎng)基（貨號CM-R141）備用；
更換第四套無菌剪刀和鑷子，先用鑷子固定骨頭，再用無菌剪刀剪下骨頭兩端；
用注射器吸取培養(yǎng)皿內(nèi)的完-全培養(yǎng)基，從骨頭一端插入針頭，反復(fù)沖洗骨髓至骨頭發(fā)白透亮，將骨髓液收集在培養(yǎng)皿內(nèi)；
用5 mL移液槍反復(fù)吹打骨髓液，將骨髓液經(jīng)200目細(xì)胞篩過濾，濾液收集于離心管內(nèi)，離心棄上清，獲得骨髓細(xì)胞沉淀。
圖2. 注射器沖洗骨髓
三、巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)分化
用含M-CSF（巨噬細(xì)胞集落刺激因子）的培養(yǎng)基刺激骨髓單個核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞。
M-CSF有兩種獲取方式：
購買商品化的M-CSF因子（推薦貨號：PCK042、PCK043、PCK044、PCK303）。M-CSF的常用濃度范圍為10-50 ng/mL，不同品牌的細(xì)胞因子使用濃度可能有所差異，需根據(jù)實際誘導(dǎo)效果調(diào)整使用濃度；
使用培養(yǎng)5-7天的L-929細(xì)胞上清[1]。將獲得的L-929細(xì)胞培養(yǎng)上清高速離心除雜，分裝后置于-20℃冷凍保存。通常使用含有20% L-929細(xì)胞上清的完-全培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)，同時可根據(jù)實際誘導(dǎo)效果，調(diào)整L-929細(xì)胞上清的含量。
圖3. 誘導(dǎo)完成的骨髓來源巨噬細(xì)胞
細(xì)胞培養(yǎng)注意事項
骨髓來源巨噬細(xì)胞體外培養(yǎng)不增殖，需注意培養(yǎng)時間，建議盡快進(jìn)行相關(guān)實驗；
骨髓來源巨噬細(xì)胞難消化，可用利多-卡因消化3 min左右（不建議超過5min），若細(xì)胞仍無法消化，更換消化液為0.25%胰蛋白酶，或使用無菌細(xì)胞刮。
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