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內皮細胞培養基配方優化:避免生長不良問題

更新時間:2025-05-16  |  點擊率:1492

內皮細胞(Endothelial Cells)是構成血管內壁的單層扁平上皮細胞,形態呈多邊形,細胞的邊緣呈鋸齒狀并相互嵌合,覆蓋于動脈、靜脈和毛細血管的內表面,形成血液與周圍組織之間的機械屏障。作為血管系統的核心功能單元,內皮細胞在基礎研究、疾病模型構建、臨床診斷和藥物篩選等方面具有廣泛的應用價值。


本期細胞學堂將為您詳細介紹內皮細胞的結構、功能及分離培養步驟,幫助您快速了解內皮細胞,順利展開相關實驗。

 

01#

內皮細胞類型的模塊化分布

內皮細胞并非單一類型,而是根據血管功能與組織需求分化為不同亞型,形成模塊化分布格局。

連續型內皮細胞(Continuous Endothelium)

結構特點:

基底膜連續,細胞間通過緊密連接(如Claudin、Occludin蛋白)形成完整的選擇性屏障。脂溶性小分子可自由擴散,而親水性小分子和水則依賴特定的轉運機制(如水通道蛋白)通過。

細胞間連接緊密,細胞間隙約為12 ?,大部分物質運輸依賴跨細胞轉運機制(如囊泡介導的白蛋白轉運)。

細胞收縮性較弱,細胞骨架肌動蛋白分布相對稀疏,整體形態穩定,通透性極低。

功能:

維持血腦屏障(BBB)、血-視網膜屏障等結構完整,保護中樞神經系統免受毒性物質侵害。

典型分布:

大腦(血腦屏障)、心臟、肺、肌肉、皮膚。

窗孔型內皮細胞(Fenestrated Endothelium)

結構特點:

細胞表面存在直徑約200-1000 ?的窗孔,大部分覆蓋由 PV-1蛋白形成的非膜性隔膜。這種結構增加了細胞對流體和溶質的通透性,但同時限制了大分子通過。

基底膜連續,允許小分子和液體的快速交換。

糖萼層在窗孔型內皮表面較為稀疏,其殘留結構仍可能參與微環境的調節和溶質交換的選擇性控制。

功能:

參與物質高效濾過(腎小球)、激素分泌(胰島毛細血管)和營養吸收(胃腸道黏膜)。

主要分布:

腎臟(腎小球)、內分泌腺(如胰島)、胃腸道黏膜。

不連續型/竇狀內皮細胞(Discontinuous/Sinusoidal Endothelium)

結構特點:

基底膜不連續或缺失,細胞間間隙較大,可達0.1-1 μm。這種結構支持大分子(如脂蛋白)和血細胞跨內皮轉運,使其能夠進入實質組織。

細胞間連接較松散,可在局部信號(免疫分子、機械應力)影響下調節血管孔隙大小,參與動態過濾功能。

功能:

高通透性結構支持大分子和血細胞交換,并在肝臟等器官中承擔免疫清除與調節功能。

主要分布:

肝臟、脾臟、骨髓等器官的血竇系統。

 


02#

內皮細胞功能模塊化體系

不同組織中的內皮細胞通過調整連接方式的組成和比例,適應其特定的生理需求,從而維持血管系統的正常功能。

連接方式

緊密連接

由跨膜蛋白(如Occludin、Claudin)與胞質錨定蛋白(如ZO-1)形成選擇性屏障,限制細胞間隙中溶質的被動擴散,在血腦屏障等關鍵部位發揮核心作用。

縫隙連接

由 Connexin 蛋白構成,允許相鄰細胞間直接傳遞離子、小分子及第二信使,實現細胞功能的快速協同,如鈣信號和代謝物的同步傳播。

黏附連接

通過鈣黏蛋白(如VE-cadherin)與肌動蛋白骨架結合,維持細胞間機械穩定性,并參與白細胞黏附與跨內皮遷移,調控炎癥和免疫應答過程。

分子標志物

功能模塊

標志分子

血管張力調節

舒張因子:一氧化氮(NO)、前列環素(PGI2)

收縮因子:內皮素-1(ET-1)、血栓素A2(TXA2)

凝血與纖溶

抗血小板聚集:NO、PGI2

纖溶:組織型纖溶酶原激活物(tPA)

抗凝:肝素樣糖胺聚糖(Heparan sulfate proteoglycans)、肝素輔因子II(Heparin cofactor II)

促凝:血管性血友病因子(vWF)、血小板活化因子(PAF)

炎癥與免疫

黏附分子:細胞間黏附分子(ICAM-1/VCAM-1)

抗菌肽:防御素β(Defensin-β)

細胞因子:白介素37(IL-37)

血管生成與修復

促血管生成:內皮生長因子A(VEGF-A)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)

促血管修復:血管生成素-1(Ang-1)、轉化生長因子-β(TGF-β)

維持血管結構

內皮標志物:CD31、鈣粘蛋白(VE-cadherin)

結構指標:微血管密度(MVD)

功能響應

物質交換功能

所有類型內皮細胞均參與氧氣、營養物質和代謝廢物交換,依其結構采用跨細胞或旁細胞通道,如連續型內皮細胞主要跨胞機制(如囊泡介導轉運)實現物質交換。

力學響應性

剪切應力可激活內皮型一氧化氮合酶(eNOS),促進一氧化氮(NO)釋放,以擴張血管,維持血流動力學穩態。

穩定的脈動血流能夠抑制炎癥因子表達,防止內皮激活與功能紊亂。

病理可塑性

在氧化應激、炎癥等病理條件下,內皮細胞可發生功能障礙,表現為通透性增加、黏附分子表達上調等。這些變化參與了動脈粥樣硬化、糖尿病血管病變等多種病理過程。

異質性中的統一性

盡管不同組織器官間內皮細胞結構和功能上存在差異顯著,但它們普遍表達一些共同的標志物(如CD31、VE-cadherin),表現出一定的統一性。

內皮細胞具有極性特征,頂端朝向血腔,基底面通過整合素等受體與基底膜結合,從而維持血管結構的完整性。

 


03#

內皮細胞的分離提取與培養

以分離人臍靜脈內皮細胞為例,操作步驟如下:

01 血管處理

臍帶采集與清洗

采集新鮮臍帶,用無菌PBS沖洗去除表面血液。

血管識別與分離

沿臍帶縱軸切開,識別單根臍靜脈(其直徑較大、壁薄,與兩條較厚且呈螺旋排列的動脈區分)。用鑷子進行鈍性剝離,去除周圍結締組織。

血管清洗與封閉

為防止殘留紅細胞和凝血-塊影響后續操作,用預冷PBS反復灌洗血管至流出液清澈(通常需5-8次)。隨后,用無菌手術夾封閉血管一端,另一端連接注射器,形成封閉系統以控制酶處理范圍。

02 消化與收集

將HUVEC專用消化酶緩慢注入血管,確保內腔充盈。隨后將血管置于37℃孵育10-15 min(注意:孵育時間不宜過長,否則易導致細胞死亡)。消化結束后,為防止消化液流出受阻,先用鈍頭針頭疏通血管下端流出口,隨后松開下端手術鉗,消化液流入一個含有內皮細胞完-全培養基的50 mL 無菌離心管中,再用完-全培養基沖洗血管內腔,收集洗脫液。將收集液以150 × g離心5 min,離心結束后,分離的內皮細胞聚集于離心管底部。小心棄去上清液,避免擾動細胞沉淀。

03 接種與傳代

用完-全培養基重懸細胞,并將細胞接種到預涂纖維連接蛋白、明膠或基底膜基質的培養瓶,促進內皮細胞貼壁和鋪展,培養24-48 h后觀察細胞貼壁情況,換液后可見典型“單層扁平排列樣"內皮細胞形態。

04 常見問題與解決方案

問題

可能原因

解決方案

細胞得率低

酶消化不充分

優化消化酶濃度,延長孵育時間

成纖維細胞污染

血管外膜未徹-底剝離

鈍性分離時避免損傷血管中膜

細胞貼壁率低

基質涂層不均勻

預涂纖維連接蛋白

細胞提前衰老

傳代次數過

限制傳代(≤5代)

氧化應激反應

添加抗氧化劑(如NAC)


 


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圖片


 


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參考文獻

[1] Ricard N, Bailly S, Guignabert C, Simons M. The quiescent endothelium: signalling pathways regulating organ-specific endothelial normalcy. Nature Reviews Cardiology. 2021;18(8):565-580.

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[4] Chandel S, Kumaragurubaran R, Giri H, Dixit M. Isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Methods in Molecular Biology. 2024;2711:147-162.


 


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